Читать «Новое в современной генетике» онлайн - страница 87

Для обнаружения генных мутаций на молекулярном уровне необходимо знать полную нуклеотидную последовательность изучаемого онкогена. В основе этой работы лежит метод рекомбинантных ДНК (см.: Баев, 1984) и затем метод секвенирования ДНК с использованием многочисленных экзонуклеаз рестрикции, а также электрофореза в полиакриламидных гелях для разделения олигонуклеотидов, которые могут отличаться по длине даже на один нуклеотид (см.: Краев, 1984). Для ряда онкогенов этими методами была изучена их структура. Это касается, например, человеческого протоонкогена c-fos (Straaten et al., 1983). Показано, что этот онкоген содержит 3415 нуклеотидов. Его кодирующие последовательности прерываются тремя интронами, он содержит четыре экзона. Транскрипт гена c-fos после сплайсинга интронов имеет в длину около 2,2 килобаз. Знание последовательности кодонов позволило определить структуру белка гена c-fos.

Кроме ретровируса HTLV, недавно был выделен второй ретровирус лейкоза человека — ATLV (Ninuma et al., 1981). Было проведено молекулярное клонирование и секвенирование вируса ATLV, показано наличие уникальных особенностей на концах LTR этого вируса (Seiki et al., 1982). Вирус ATLV в целом содержит 9032 пары оснований. Знание кодирующих последовательностей позволяет определить характер белка, синтезируемого по сигналам генома вируса (Seiki et al., 1983). Определена полная нуклеотидная последовательность вируса, вызывающего лейкемию Абел-сона у мышей (А-Mu LV). Кодирующая последовательность вируса содержит кодоны для синтеза белка в составе 918 аминокислот с молекулярной массой в 102,000 дальтон. Вирус кодирует, как и многие другие онковирусы, белок с участием гена gag (Reddy et al., 1983).

Определена нуклеотидная последовательность онкогена с-шус человека в сравнении с последовательностью v-myc кур. Установлена гомология кодирующих районов и онкобелков. Эволюционные различия касаются интронов (Watson et al., 1983b).

Была изучена нуклеотидная последовательность длинного терминального повтора LTR у вируса HTLV-II. Ретро-вирусы, которые не несут клеточного онкогена, могут вызывать специфические заболевания. Имеются их онкогенные и неонкогенные формы. Установлено, что их различия связаны с изменениями нуклеотидов в 43-м участке LTR, который влияет на транскрипцию генома вируса (Shimo-tohno et al., 1983).

Начиная с исследований 1982 г. появились факты о генных мутациях, превращающих протоонкогены в онкогены. Первым примером явилось нахождение мутаций в онкогене ras. Онкоген был выделен из линии раковых клеток мочевого пузыря человека. М. Гольдфарб и соавторы (Goldfarb et al., 1982), Е. К. Ших и Р. Вейнберг (Shih, Weinberg, 1982), С. Пульциани и соавторы (Pulciani et al., 1982b), используя методы определения последовательности нуклеотидов, показали, что у онкогена эта последовательность в основном повторяет последовательность неактивированного протоонкогена. Отсюда следовало, что если причина появления онкогена коренится в мутациях, то они захватывают минимальный участок в ДНК протоонкогена.