Читать «Журнал «Компьютерра» № 9 от 7 марта 2006 года» онлайн - страница 35

Все имеющиеся в растворе гены коралла мы введем в бактерии так, чтобы каждая из них получила один ген. Бактерии в норме «не умеют» флуоресцировать — если мы найдем флуоресцентную бактерию, значит, внутри нее работает (экспрессируется) ген флуоресцентного белка из коралла. Молекулярные биологи часто используют в своих целях лабораторные штаммы кишечной палочки E. coli (эти бактерии относительно безопасны для человека, какое-то их количество всегда присутствует в нашем кишечнике).

Отличительной чертой бактерий является то, что часть генетической информации у них содержится в коротких кольцевых молекулах ДНК — плазмидах. Многие биотехнологические компании торгуют очищенными плазмидами (векторами), специально предназначенными для решения разных молекулярно-технологических задач. Нам необходимо купить или попросить у знакомых биологов вектор для экспрессии чужеродных генов в бактериях, вставить в него нашу кДНК и перенести полученную конструкцию в бактерию.

Рестриктаза

Чтобы все это сделать, мы должны сначала разрезать кольцевую молекулу ДНК вектора. Для этого используются специальные ферменты — рестриктазы, сама реакция называется рестрикцией. В природе рестриктазы используются бактериями для защиты от чужеродной ДНК; генному инженеру набор рестриктаз, хранящийся в морозильнике, столь же необходим, как ножницы портному. Рестриктазы узнают и разрезают строго определенные нуклеотидные последовательности, которые называются сайтами рестрикции. Для каждой рестриктазы есть свой сайт узнавания ДНК, обычно включающий в себя от четырех до восьми расположенных подряд нуклеотидов. Вектора, предназначенные для клонирования, содержат специальный полилинкер — десяток идущих друг за другом разных сайтов рестрикции, перед которым находится промотор — последовательность нуклеотидов, с которой бактерии начинают считывать РНК любого гена.

Молекулярный ОТК

«Технический контроль» и отбраковку неправильно изготовленных белковых молекул осуществляют опять-таки белки. Обнаруживает дефектные молекулы белок паркин, который «навешивает» на них специальные «бирки» — что-то вроде табличек «Брак!». Эти «бирки» — цепочки молекул убиквитина, прикрепленные к «неисправным» белкам, — являются инициаторами начала работы белковых структур под названием протеосомы.

Протеосомы выполняют функции «баз разделки» (такие существуют на флоте и в авиации), где разбирают на запчасти и режут на металлолом отслужившие свой срок корабли и самолеты. Аналогично «поступают» и протеосомы. Помеченные убиквитином белковые молекулы они «разбирают на запчасти» — деструктурируют до отдельных аминокислот, которые могут быть вновь использованы для «производства» любых других белковых молекул.

Лигаза

Добавим к выбранному нами вектору рестриктазу и подходящий для ее работы солевой раствор (он прилагается к купленному ферменту) и поставим пробирку в термостат, разогретый до 37 °С. Через час все кольцевые молекулы вектора в растворе станут линейными — рестриктаза нашла свой сайт на полилинкере и разрезала в этом месте ДНК. Теперь смешаем разрезанный вектор и кДНК и добавим новый фермент — лигазу. Если рестриктаза играет в нашей работе роль ножниц, то лигаза, наоборот, является иголкой, сшивающей две молекулы ДНК. Спустя несколько часов все молекулы вектора снова станут кольцевыми, но теперь внутри полилинкера в каждой из них будет содержатся по одной молекуле кДНК. Правда, некоторые молекулы вектора «зашились» обратно сами на себя — для борьбы с этим явлением существуют специальные способы, но мы сейчас обойдемся без них, просто возьмем в следующую стадию побольше ДНК и будем надеяться на лучшее.