Читать «Журнал «Компьютерра» № 9 от 7 марта 2006 года» онлайн - страница 34
Компьютерра
Для проведения полимеразной цепной реакции добавим к одноцепочечной кДНК полимеразу, оптимизированный для ее работы солевой буфер, смесь нуклеотидов и два праймера, соответствующих добавленным на концы кДНК адаптерам. Теперь нам понадобится специальная лабораторная установка — амплификатор. Несмотря на свою дороговизну (а стоит такой прибор как автомобиль) амплификатор представляет собой всего лишь хороший программируемый термостат, способный быстро менять температуру. Ставим пробирку в амплификатор и запускаем программу: прибор должен сначала прогреть раствор до 95 °С, затем снизить температуру до 60 °С, затем подержать пару минут 72 °С и начать все с начала. В принципе, вместо амплификатора можно использовать три термоса с подогретой водой — раньше так и делали, только рука устает пробирку переносить. Давайте теперь посмотрим, что же будет происходить в нашей смеси.
При температуре 95 °С цепочки ДНК и РНК отходят друг от друга. РНК нас больше не интересует, скорее всего она развалится в ближайшее время. Когда температура опускается до 60 °С, один из праймеров прилипает к соответствующей ему нуклеотидной последовательности адаптера на конце молекулы ДНК. При последующем повышении температуры до 72 °С начинает работать термостабильная ДНК-полимераза — мы как раз достигли оптимальной для этого фермента температуры. Полимераза «садится» на прилипший праймер и, перемещаясь по молекуле, начинает присоединять к ней нуклеотиды.
За первый цикл полимеразной цепной реакции ДНК-полимераза построила комплиментарные цепи для каждой одноцепочечной молекулы кДНК, находящейся в реакционной смеси. Теперь мы получили полноценную двухцепочечную ДНК, но завершать реакцию пока рано — нам необходимо наработать больше материала. ПЦР продолжается: 95 °С — цепи ДНК расходятся; 60 °С — праймеры садятся на ДНК; 72 °С — полимераза достраивает праймеры, превращая их в новые цепи ДНК. За каждый цикл количество ДНК в пробирке удваивается; таким образом, за двадцать циклов ПЦР для каждой молекулы ДНК мы получаем 220 точных копий. Вся работа заняла около часа, ксероксам подобные скорости и не снились. Итак, мы имеем достаточно ДНК, а главное, всегда сможем дополнительно ее амплифицировать, проведя еще одну полимеразную цепную реакцию.
Теперь в нашей пробирке плавает не меньше миллиона копий гена зеленого флуоресцентного белка. Однако в том же растворе находятся еще миллиарды копий других молекул ДНК, и нам надо как-то «отделить зерна от плевел». Мы уже знаем, что физико-химические методы здесь не годятся: разные молекулы ДНК слишком похожи друг на друга. Для поиска гена зеленого флуоресцентного белка мы воспользуемся главным свойством именно этого белка — флуоресценцией.
