Читать «Биологическая химия» онлайн - страница 7

Стратегические принципы изучения первичной структуры белка претерпевали значительные изменения по мере развития и усовершенствования применяемых методов. Следует отметить три основных этапа в их развитии. Первый этап начинается с классической работы Ф. Сенгера (1953) по установлению аминокислотной последовательности инсулина, второй – с широкого введения в структурный анализ белка автоматического секвенатора (начало 70-х годов 20 века), третий – с разработки скоростных методов анализа нуклеотидной последовательности ДНК (начало 80-х годов 20 века).

Первичная структура белка определяется:

1. Природой входящих в молекулу аминокислот.

2. Относительным количеством каждой аминокислоты.

3. Строго определенной последовательностью аминокислот в полипептидной цепи.

Предварительные исследования перед определением первичной структуры белка

1. Очистка белка

2. Определение молекулярной массы.

3. Определение типа и числа простетических групп (если белок конъюгированный).

4. Определение наличия внутри- или межмолекулярных дисульфидных связей. Обычно одновременно определяют наличие в нативном белке сульфгидрильных групп.

5. Предварительная обработка белков, обладающих 4-й структурой, с целью диссоциации субъединиц, их выделения и последующего изучения.

Стадии определения первичной структуры белков и полипептидов

1. Определение аминокислотного состава (гидролиз, аминокислотный анализатор).

2. Идентификация N- и С-концевых аминокислот.

3. Расщепление полипептидной цепи на фрагменты (трипсин, химотрипсин, бромциан, гидроксиламин и др.).

4. Определение аминокислотной последовательности пептидных фрагментов (секвенатор).

5. Расщепление исходной полипептидной цепи другими способами и установление их аминокислотной последовательности.

6. Установление порядка расположения пептидных фрагментов по перекрывающимся участкам (получение пептидных карт).

Методы определения N-концевых аминокислот

1. Метод Сенгера.

2. Метод Эдмана (реализован в секвенаторе).

3. Реакция с дансилхлоридом.

4. Метод с применением аминопептидазы.

Методы определения С-концевых аминокислот

1. Метод Акабори.

2. Метод с применением карбоксипептидазы.

3. Метод с применением боргидрида натрия.

Общие закономерности, касающиеся аминокислотной последовательности белков

1. Не существует одной уникальной последовательности или группы частичных последовательностей, общих для всех белков.

2. Белки, выполняющие разные функции, имеют разные последовательности.

3. Белки со схожими функциями имеют похожие последовательности, однако совпадение последовательности проявляется обычно лишь в малой степени.

4. Одинаковые белки, выполняющие одинаковые функции, но выделенные из разных организмов, обычно имеют значительное сходство в последовательности.

5. Одинаковые белки, выполняющие одинаковые функции и выделенные из организмов одного вида, почти всегда обладают совершенно одинаковой последовательностью.

Высшие уровни структуры белков, их биологическая активность тесно связаны и фактически определяются аминокислотной последовательностью. То есть, первичная структура генетически детерминирована и определяет индивидуальные свойства белков, их видовую специфичность, на ее основе формируются все последующие структуры.