Читать «Что, если Ламарк прав? Иммуногенетика и эволюция» онлайн - страница 74

Подобно всем новым научным гипотезам, экспериментам и интерпретациям пионерская работа Элистэра Каннингема вызвала споры. Однако к 1981 г. поток публикаций из лабораторий Патрисии Гирхарт (Gearhart), Урсулы Сторб, Эла Ботуэлла (Bothwell), Лероя Худа (Hood), Дэвида Балтимора и Клауса Раевского подтвердил правильность основного предположения Каннингема. Было показано, что у мышей мутации в ДНК-последовательности перестроенного V(D)J-reHa вариабельной области появляются после стимуляции антигеном. Дальнейшие доказательства были получены в новых экспериментах с трансгенными мышами.

Все эти работы стали возможными благодаря разработке в 1975 г. методов «гибридомы» и «моноклональных антител». За создание этих методов Георг Келер и Цезар Мильштейн получили в 1983 г. Нобелевскую премию (совместно с Нильсом Ерне). В этих методах используется слияние раковой клетки (способной расти и неограниченно делиться в культуре) с индивидуальной В-клеткой иммунизированного животного. Гибридная клетка продуцирует антитело В-клетки и приобретает бессмертие раковой клетки. Такие гибридомы позволили экспериментально показать существование клонов В-клеток, предсказанное клонально-селекционной теорией Бернета, причем все потомки одной клетки имеют одинаковые V(D)J-гeны и, таким образом, производят одинаковые антитела. Клон гибридомных клеток дает возможность сравнить ДНК-последовательности соматически перестроенного V(D)J-гена В-клеток и последовательности V-элемента зародышевой линии. Во многих случаях было показано, что В-клетки, изолированные после стимуляции антигеном, накапливают много соматических мутаций в том участке V-элемента, который кодирует последовательность аминокислот от 1-й до примерно 85-й позиции и включает первые два гипервариабельных участка (см. рис. 5.3). Эти данные соответствуют предположению об отборе антигеном в центрах размножения. Частота соматических мутаций очень высока: ДНК-последовательность, включающая перестроенный V(D)J-ген, накапливала изменения, которые отличались от немутантной последовательности зародышевой линии примерно по 5 процентам оснований.

Как мутации распределены по участку-мишени?

Нам известно, что соматические мутации локализованы в короткой ограниченной области ДНК В-клетки. Экспериментальные данные суммированы на рис. 5.5, где показаны перестроенный VDJ-ген тяжелой цепи в начале реакции в центре размножения и та же последовательность через семь и четырнадцать дней. Обратите внимание, что доля мутаций, по-видимому, увеличивается со временем, и что мутации ограничены ближайшим окружением перестроенного VDJ-гена и некодирующими фланкирующими (расположенными по краям) ДНК-последовательностями. Их не находят около промоторного сай-та, с которым связывается РНК-полимеразный ферментный комплекс и с которого начинается (инициируется) копирование мРНК по матрице ДНК (в кэп-сайте, обозначенном на рисунке маленькой витой стрелкой выше лидерного L-кодирующего участка). Не обнаруживаются они и за участком, который, по нашим предположениям, является «локус-специфичным устройством» (Ei/MAR, intronic Enhancer/Matrix Attachment Region).