Читать «Наука воскрешения видов. Как клонировать мамонта» онлайн - страница 43

В этих экспериментах ученые использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации (создания копий) ДНК насекомых (рис. 6). ПЦР была разработана в 1983 году Кэри Муллисом, который тогда работал биохимиком в компании Cetus Corporation. Технологии секвенирования ДНК сделали возможным определение точной последовательности нуклеотидов в участке ДНК. Однако эти технологии требовали миллионов клональных копий целевого фрагмента. До изобретения ПЦР этого добивались с помощью бактерий, которые стимулировали захватывать и встраивать в свой геном случайные фрагменты ДНК. Затем из этих бактерий вырастали колонии, в которых каждая бактериальная клетка содержала идентичную копию случайно захваченного фрагмента ДНК: в результате получалось достаточное количество копий, чтобы секвенировать этот участок. ПЦР представляет собой намного более быстрый способ копирования ДНК, а кроме того, и это важнее, она позволяет целенаправленно выбирать участки генома, которые мы будем копировать. Сейчас ПЦР – один из наиболее широко используемых и фундаментальных методов молекулярной биологии.

Рис. 6. Полимеразная цепная реакция, или ПЦР. ПЦР – распространенный метод молекулярной биологии, используемый для создания миллиардов копий фрагментов ДНК путем повторного нагревания и охлаждения ДНК в присутствии ДНК-полимеразы (фермента, участвующего в репликации ДНК), при этом из свободных нуклеотидов строятся копии цепочек ДНК и ДНК-праймеры, определяющие, какая часть генома должна быть скопирована

Полимеразная цепная реакция удивительно проста, учитывая революционные последствия ее появления. Чтобы представить себе этот процесс, вообразите, что мы хотим лучше разобраться в генетических различиях между домашними и дикими курами. Считается, что в одомашнивании кур важную роль сыграл ген рецептора тиреотропного гормона (рТТГ), ускоряющий размножение этих птиц. Мы предлагаем использовать ПЦР для амплификации (создания копий) этого гена, извлеченного из ДНК домашней курицы, и из сохранившихся останков древних кур, живших во времена, когда этих птиц еще не одомашнили. Затем мы секвенируем результаты ПЦР, чтобы определить последовательность нуклеотидов в этом гене и выяснить, отличается ли этот ген у домашних кур и их диких родственников и предков, живших в эпоху, предшествовавшую одомашниванию.

Вначале мы должны каким-то образом определить целевой фрагмент ДНК, соответствующий гену рТТГ. Для этого мы создаем ДНК-зонды, называемые праймерами, которые соответствуют участкам ДНК, примыкающим с двух сторон к гену рТТГ. Затем мы создаем смесь, содержащую эти праймеры, предварительно выделенную ДНК курицы, свободные азотистые основания и полимеразу – фермент, работа которого заключается в копировании ДНК. Теперь мы можем начать процесс копирования. Мы нагреваем нашу смесь, чтобы разрушить водородные связи, соединяющие вместе две нити ДНК. Когда молекула полностью разделяется на две нити, мы повторно охлаждаем смесь, вследствие чего они снова соединяются вместе. Поскольку праймеры имеют небольшую длину и в растворе их много, в первую очередь происходит присоединение двух праймеров к тем участкам генома, которым они должны соответствовать, – участкам, примыкающим к гену рТТГ, – и формируется двухцепочечная ДНК на этом участке генома курицы. Наконец, под воздействием полимеразы между праймерами достраивается недостающий участок – ген рТТГ. При этом одна цепочка ДНК выступает в роли шаблона, а свободные нуклеотиды достраиваются к ней, дополняя недостающую последовательность. По окончании этого процесса число копий гена рТТГ удваивается. Чтобы получить достаточное число копий для секвенирования, мы повторяем весь цикл 30–40 раз в течение нескольких часов и в итоге получаем триллионы идентичных копий гена рТТГ.